Nano DSC
Specificatii tehnice
- Nivel zgomot pe termen scurt: 0.015 μW
- Repetabilitatea liniei de baza: 0.028 μW
- Temperatura de Operare: -10… 130°C optional …160˚C
- PPC: incorporat, pana la 6 atmosfere
- Viteza scanare: 0.0001… 2˚C/min
- Timp de raspuns: 5 secunde
- Volum Celula: 0.33 ml
- Material Celula: Platina sau Aur
- Geometrie Celula: Fixa, capilara continua sau cilindrica continua
- Tip masurare caldura: Compensare de Putere
Microcalorimetrele TA Instruments din seria Nano reprezinta cea mai inalta sensitivitate si performanta neegalata, pentru investigarea probelor biologice. Nano DSC este dedicat determinarii stabilitatii termice si capacitatii calorice a proteinelor si a altor macromolecule in solutii diluate, cu versatilitatea si precizia necesare efectuarii de scanari ale stabilitatii moleculare, tariei liganzilor si a masuratorilor de perturbare a presiunii.
Technologia Nano DSC
Calorimetrele cu scanare diferentiala (DSC) masoara cantitatea de caldura absorbita sau degajata de o proba in timp ce este incalzita sau racita. Instrumentele clasice DSC sunt destinate unei largi game de aplicatii, dar cel mai des lipseste sensibilitatea necesara studiului probelor biologice. Macromoleculele cum ar fi proteinele raspund la incalzire sau racire prin denaturare la o temperatura caracteristica. Cu cat biopolimerul este intrinsec mai stabil, cu atat punctul de mijloc al tranzitiei va fi situat la o temperatura mai mare. Deoarece aceste procese sunt exoterme, cu degajare de caldura de nivelul microjoulilor, sensibilitatea Nano DSC este critica pentru investigarea cu succes a reactiei.
Baza oricarui calorimetru este traductorul fluxului de caldura. Nano DSC beneficiaza de un design inovator dublu capilar, principiul de operarea fiind compensarea de putere. Utilizarea capilarelor are avantajul de a intarzia de cele mai multe ori amorsarea agregarii proteinelor dupa ce denaturarea este completa. Rezultatul este o masuratoare calorimetrica cu scanare diferentiala de o sensibilitate, acuratete si precizie neegalate. De fapt, datele obtinute in mod obisnuit pe Nano DSC nu pot fi obtinute nicicum pe un alt aparat. In pluc, celulele capilare pot fi curatate rapid si eficient datorita faptului ca suprafeta interna a celulei a fost deja spalata cu solutie de curatare.
Nano DSC beneficiaza de elemente termoelectrice solide pentru controlul precis si directionat al temperaturii probei. Aceeasi sensitivitate este mentinuta atat in baleierea crescatoare a temperaturii cat si in cea descrescatoare, pentru ca aceleasi elemente sunt utilizate atat pentru incalzire cat si pentru racire. Viteza de scanare este variabila in intervalul 0.0001 – 2 ºC/min.
Controlul presiunii este mentinut de Nano DSC printr-un piston incorporat de inalta presiune dirijat de un dispozitiv de activare liniar controlat de computer. O presiune constanta este aplicata in timpul experimentului de calorimetrie diferentiala cu scanare pentru a obtine valorile capacitatii calorice la o presiune constanta si totodata pentru prevenirea formarii bulelor sau a fierberii. Variatia presiunii este o functie definita de utilizator in timpul experimentelor ce implica experimente PPC (pressure perturbation calorimetry) pentru a obtine date privind compresibilitatea si expansiunea termica.
Determinarea parametrilor termodinamici ai proteinelor prin calorimetria diferentiala cu scanare (DSC) utilizand Nano DSC necesita sensibil aceleasi cantitati de proba ca si studiile de rezonanta a plasmonilor de suprafata sau de fluorescenta. Datorita sensitivitatii extreme si a reproductibilitatii liniei de baza, precum si a volumului mic de proba necesar (300 μl) si a configuratiei (ce intarzie declansarea agregarii ireversibile si precipitarii proteinelor), rezultatul este o scanare completa, interpretabila si precisa pentru practic orice proteina de interes. Sensitivitatea si acuratetea Nano DSC este demonstrate de datele de mai jos. Lisosomii din albusul de ou (in buffer glicina pH 4.0) au fost preparati la diferite concentratii. O cantitate minima de 2 μg de lisosomi in celula capilara este necesara pentru asigurarea unor valori de inalta calitate pentru toti cei 4 parametrii termodinamici!
Investigarea legaturilor dintre proteine si liganzi
DSC reprezinta o abordare valoroasa privind legaturile dintre o macromolecula biologica si un ligand – cum ar fi un alt biopolimer sau un medicament. Spre deosebire de ITC (calorimetria cu titrarea izotermica), DSC permite corelarea dintre termodinamica ce dirijeaza taria legaturii cu schimbarile conformationale in interiorul macromoleculei datorate reactiilor de legare. DSC este util mai ales pentru caracterizarea interactiilor foarte stranse sau a celor foarte lente. De asemenea, DSC permite caracterizarea reactiilor de legare ce sunt incompatibile cu solventii necesari in unele ecperimente ITC (de exemplu, acolo unde solubilitatea ligandului pentru un experiment ITC necesita concentratii de solvent netolerate de proteine). Figura de mai jos arata scanarea calorimetrica a Rnazei A legata cu concentratii crescatoare de 2’-CMP, aratand stabilizarea proteinei prin adaugarea unei concentratii crescute de inhibitor. Date essential identice au fost obtinute in prezenta a 5% DMSO, demonstrand compatibilitatea solventilor organici cu tehnica DSC.
Caracterizarea stabilitatii proteinelor
Analiza stabilitatii uneim proteine in solutii diluate implica determinarea variatiei capacitatii calorice partial molare a proteinei la o presiune constanta (ΔCp). Contributia proteinei in capacitatea calorica masurata calorimetric (Cp partiala) este determinata prin sustragerea scanarii unui blank din scanarea probei inainte de analiza in sine. Incalzirea probei de proteina produce initial o linie de baza usor crescatoare dar pe masura ce incalzirea progreseaza, caldura este absorbita de catre proteina si produce scindarea ei de-a lungul unui intreval de temperatura caracteristic acelei proteine, provocand aparitia unui peak endotermic (vezi figura de mai jos). O data ce scindarea este completa, absorbtia de caldura scade si o noua linie de baza este creata. Dupa sustragerea blank-ului, datele pot fi analizate pentru a oferi o caracterizare termodinamica completa a procesului de scindare.
Caracterizarea structurii proteinelor
DSC poate fi utilizata pentru a caracteriza atat legatura specifica unui ligand (de exemplu, legarea unui medicament de un receptor), cat si legarea nespecifica (de exemplu, legarea detergentilor de partile hidrofobice ale suprafetei unei proteine). In unele cazuri, legarea liganzilor, chiar intr-o parte speficica a receptorului, are ca rezultat rearanjarea structurala de lunga durata a proteinei, fapt ce destabilizeaza intregul process. Figura de mai jos arata scanarile DSC ale α-lactalbuminei bovine saturata cu ioni Ca2+ pentru diferite proteine: raportul
Zn2+ scanat cu viteza de 1°C/min. Punctul mijloc al scindarii termice a proteinei descreste de la 65 °C in absenta Zn 2+ la 35 °C la un raport proteina: Zn 2+ de 1:70; proteina precipita la concentratii mari de Zn 2+. Entalpia scindarii descreste de asemenea substantial o data cu cresterea concentratiei de Zn 2+.
Permeabilizarea membranelor prin medicamentatie
Unele medicamente sunt special proiectate a fi solubile prin efervescenta si eliberate lent in vivo dupa o perioada de cateva saptamani sau luni. Aceste medicamente au eficienta scazuta in cazul in care nu penetreaza membranele celulelor tinta. In scopul masurarii eficientei potentiale a medicamentelor inaintea experimentelor in vivo, Nano DSC poate fi utilizat pentru a monitoriza schimbarile survenite in compozitia fazei sistemului model de lipozomi pe masura ce medicamentul patrunde in suprafata exterioara, stratul dublu, si in final traverseaza membrana si patrunde in lipozom. Lipozomii DMPC la un lH 7 au fost combinati cu o suspensie de medicament hidrofobic cu dizolvare lenta. Scanarea temperaturii a fost efectuata in intervalul 25 – 60 °C cu o viteza de scanare de 1°C/min, apoi scanata din ora in ora.
Variatia graduala a compozitiei de faza cu timpul (vezi figura de mai jos) arata cum penetrarea medicamentului schimba proprietatile fizice ale lipozomului.
